La primera investigación se abrió en 2013 a raíz de unos comentarios incendiarios que realizó Mateen a sus compañeros de trabajo en los que afirmaba tener relación con organizaciones terroristas, ha explicado el encargado de la investigación, el agente especial del FBI Ron Hopper en rueda de prensa desde Orlando: "El FBI investigó minuciosamente la cuestión, entrevistó a testigos, realizó un seguimiento físico y comprobó los archivos".
Durante esta investigación se interrogó dos veces al propio Mateen, pero "no se pudo verificar la veracidad de sus afirmaciones", por lo que se cerró la investigación. Al año siguiente, en 2014, se investigó a Mateen por su presunta relación con Omar Abu Salah, un suicida estadounidense. "Entonces concluimos que su contacto fue mínimo y no suponía una relación sustancial ni una amenaza", ha argumentado Hopper.
Hopper ha confirmado que el propio Mateen llamó al número de emergencias 911 y que juró lealtad al líder del Estado Islámico, Abú Bakr al Baghdadi. Además, ha señalado que el sospechoso no estaba siendo vigilado en estos momentos y que no buscan a un segundo sospechoso. Durante la rueda de prensa también ha comparecido un portavoz de la Oficina de Alcohol, Tabaco y Armas de Fuego que ha revelado que Mateen adquirió legalmente la pistola y el fusil de asalto utilizados durante el ataque en la última semana.